高效液相色谱法方法开发技巧之找到目标峰

在液相色谱方法开发的过程中，一个总的原则是：先找到目标峰，然后调整峰形和分离，再进一步完善。

找到目标峰，如果是已知目标化合物，可通过标准品来进行确定。如果是未知复杂样品，则需要根据自己实验的目的和样品本身来进行判断。在不了解样品信息的情况下，通常最好选择C18柱作为初始的选择。因为C18柱使用最多，手头上一般都会有现成的柱子可尝试，而且C18的保留机理也最为简单，我们对它的保留性能最了解和最熟悉的，通过样品在C18柱上的获得的信息，我们可以预测其极性等性质，方便调整实验方法。

找到目标峰说起来很简单，实际上在实验过程中还是经常会碰到很多的问题，例如，峰没有

1.
峰没有保留
在碰到峰没有保留这种情况的时候，首先可以先调整一下流动相的洗脱强度，降低流动相的洗脱能力，下表列出了在各种色谱模式下，如何改变溶剂的洗脱能力，可参照这个表格进行调整。

下图为一个通过调节流动相洗脱能力，增强化合物保留的例子。随着流动相中乙腈比例的降低，目标化合物的保留随之增强，且达到基线分离的效果。

如果调整了流动相洗脱能力之后保留还是没有改善，则可以通过改变流动相条件或者更换其他的固定相或者对样品进行衍生化处理等进行调整。

例如对于酸性或碱性化合物，改变流动相的pH值，使得目标化合物在流动相中呈中性状态，可以增加目标化合物的保留；还可以在流动相中添加相应的离子对试剂，以增强保留。另外还可以考虑更换固定相，如换成具有极性选择性的高碳载量的反相C18柱；或采用离子交换或者HILIC模式进行分离。

对于中性化合物，则更多需要考虑更换固定相，如具有极性选择性的高碳载量的反相C18柱；或者选择HILIC模式或正相分离的模式进行分离。

对于两性化合物，如氨基酸之类的样品，还可以考虑对样品进行衍生化处理，以增强在固定相上的保留。

例如对于酸性或碱性化合物，改变流动相的pH值，使得目标化合物在流动相中呈中性状态，可以增加目标化合物的保留；还可以在流动相中添加相应的离子对试剂，以增强保留。另外还可以考虑更换固定相，如换成具有极性选择性的高碳载量的反相C18柱；或采用离子交换或者HILIC模式进行分离。

对于中性化合物，则更多需要考虑更换固定相，如具有极性选择性的高碳载量的反相C18柱；或者选择HILIC模式或正相分离的模式进行分离。

对于两性化合物，如氨基酸之类的样品，还可以考虑对样品进行衍生化处理，以增强在固定相上的保留。

2.
没有出峰

在碰到样品没有出峰的情况，首先考虑是否是因进样浓度太小，运行时间不够，仪器和色谱柱故障，样品是否降解变质，检测器（检测波长）的选择是否准确等问题导致的。如果排除上述问题，样品仍未出峰，则很有可能是样品在固定相上保留太强，这样可以先调整流动相的洗脱能力，增强对化合物的洗脱，或者更换更合适的固定相，如反相C18换成碳载量低一些的C18或者短碳链的反相柱如C8等。

3.
有其他杂峰干扰

如果碰到有其他峰干扰的情况，可以先做一个空白实验，排除试剂、色谱柱和仪器系统污染或梯度变化等导致的空白杂峰的干扰。（TIPs：空白实验应该如何做呢？除不加样品之外，采用完全相同的样品处理、分析步骤、试剂和用量，进行平行操作。在这里建议大家在做完空白实验之后，再进几针样品来做进一步判断。）排除空白干扰之后，如果还无法判断目标峰的位置，对于已知化合物，通常可通过标准品来确定出峰的位置；对于未知样品的复杂样品，可以根据自己的实验目的，考虑样品是否需要制备纯化，再通过其他分析鉴定对样品中各组分进行其他定性定量分析（如红外，质谱，核磁等）。

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