海藻胞内蛋白藻胆蛋白提取之细胞破碎方法概述

1.前言

藻胆蛋白是藻类中最有代表性、最有应用价值与潜力的天然产物。在藻类细胞内，参与组成藻胆体，进而参与光合作用，藻胆蛋白是除了叶绿素a以外的另一种光合色素蛋白，藻胆蛋白水溶性非常的强，它存在于细胞内，所以如果我们想要得到纯度非常高、回收率非常高的藻胆蛋白，那么第一步对藻体破碎就非常的重要。最近这几年，伴随着高新技术企业尤其是生物技术产业的快速、迅猛的发展，新型破壁法如液氮研磨法、酶解法、超声波辅助提取、微波辅助提取和多针-板电晕放电技术提取法等新型破壁法已经应用于到了藻胆蛋白的提取工艺上^[1]。与传统的物理法、化学法破壁法相比，这些新型方法更加高效和温和，成本花费也更低，所得蛋白质纯度更高、稳定性更好。

2.胞内蛋白提取细胞破碎方法

2.1反复冻融法在反复冻融时，因为细胞内可以形成大量的冰晶物质，参与的溶液中的盐的浓度特在不断增加，所以会使细胞破碎。在使用反复冻融法时，其中的冻结时间对目标蛋白-藻胆蛋白的提取的量有着十分明显的影响。如果不经过冷冻这一步骤，将会有大量色素不能沉淀析出，因此，吸光度值将大幅偏低。每次冷冻超过8h或4h后，再进行两次冷冻解冻，色素蛋白含量则能趋于稳定，但重复次数的增加，不仅耗时长，而且容易造成蛋白的损失^[2]。但是，这种方法操作起来比较的简单容易，十分适用于实验室中进行科研时对非常少量的藻类材料的处理，特别的方便易行。

2.4化学试剂处理法细胞壁或细胞膜的渗透性能够被一些有机溶剂（如苯等）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学试剂改变，这样一来，细胞内的内容物就会有选择性地渗出。林红卫等人^[5]曾用过十二烷基苯磺酸钠处理钝顶螺旋藻，处理后，钝顶螺旋藻的细胞膜遭到破坏，藻蓝蛋白就可以被提取出来，他们这种操作情况下，提取率能达到98%，同时，运用这种方法对PBP的提取效率就非常明显的高于了用冻融法提取的对照组。张建平等^[6]将多管藻浸泡于0.2%的NaNO3溶液中4-5d，同样将植物组织的细胞膜毁坏，藻胆蛋白从胞内流出，从而我们可以进行后续的提取。这种化学试剂处理的方法由于其操作简单且提取率高非常适用于大量样品的制备，可是，由于化学试剂的引入，后期纯化的难度大大加剧，更重要的是，蛋白质在这种情况行会非常容易变性。

2.5溶胀法溶胀法是在恒定的pH值和适当的温度下，利用组织细胞中原有的酶系统破坏细胞。为了防止细胞溶胀时细胞被其他物质所污染，可以使用少量的防腐剂，例如甲苯、氯仿等，一些研究人员将紫菜直接浸泡在水中以获得含有PE的提取物。韦萍等^[7]研究了巨螺旋藻的藻蓝蛋白提取，发现使用15 g/L的NaNO3或者是10 mmol/LCaCl2对巨螺旋藻进行浸泡的提取效果相对比较好。余九九等^[8]把螺旋藻浸泡在蒸馏水或低浓度CaCl2溶液中，在40°C条件下进行。溶胀法虽然操作比较简单，但是需要的提取时间非常的长，要耗费很多工夫，在蒸馏水中浸泡需要10 d，在低浓度CaCl2溶液中也要浸泡3-4 d，所以说效率就比较低。

2.6酶法酶解法即利用溶菌酶、纤维素酶、纤维素酶、过氧化氢酶、半纤维素酶、脂肪酶等各种水解酶来分解细胞壁从而释放出细胞内物质。具有多糖结构的纤维素是海藻细胞壁的主要成分，所以可以利用纤维素酶或果胶酶对海藻细胞壁进行水解，这样可以降低细胞壁与细胞间介质之间的传递阻力，有利于藻胆蛋白的高效外流^[3,9]。有研究者把螺旋藻放在KCl和溶菌酶中处理，使得细胞壁得到破坏，从而提取藻蓝蛋白，这种方法细胞破损率可以达到95%以上，而且提取率也比较可观，能达到13%。联合酶液的提取比单一酶提取的效果更好，收率和纯度都会更高。与传统的碱性提取法相比，酶解法的反应条件较温和，不易引入杂质，能保持蛋白质的结构、构象和光学特性的稳定，这就为我们大规模地开发藻胆蛋白提供了一条新的思路^[11]。但是，酶解法也有一个缺点，在这个过程中，会非常容易产生产物抑制，我们猜测，这也是使得细胞内目的产物溶出速率降低的一个十分重要的原因。

2.7液氮研磨法液氮的温度为-196℃，因此，在这种情况下，就可以抑制微生物的生长，最大程度的保护组织成分不被破坏和降解，还可以增加藻体组织的硬度和脆性，使其易于研磨。通常情况下，在使用验单研磨法时，时将藻体用液氮处理，从而使组织细胞完全冻结，然后将组织研磨成粉末，再放在缓冲液中解冻，最后用高速离心法的方法对粗提物进行浓缩。Soni等人^[10]就运用了这种方法，他们在液氮条件下对藻体进行研磨使其成为粉末状，接着，把这些粉末放在了Tris-HCl缓冲液中来进行解冻。结果表明,提取得到的C-CPC纯度能够达到0.42。与传统的破壁法相比，液氮粉碎法不仅能有效保留蛋白质的活性，而且具有操作简便、成本低、可扩展性好等优点，可应用于大规模海藻组织细胞的粉碎。

2.8微波辅助提取法微波辅助提取法也是近年来兴起的一种新型的蛋白质提取技术，与传统的提取方法比较，这种方法在目标蛋白提取的纯度上更高，提取时间上也更短，所以是具有比较明显的技术操作上的优势的。为防止因处理时间过长、温度过高而导致蛋白质失活而带来的后果，所以在应用这种方法时应严格控制好处理的时间和处理的温度。JUIN等人^[14]在提取紫球藻中的藻红蛋白时，就采用了微波辅助法。研究结果表明，在40℃条件下，藻红蛋白受热仍能保持在一个稳定状态，而且微波照射10s后藻红蛋白的纯度能达到2.2。因此，在产品的纯度、可扩展性和生产成本上，微波辅助提取都不失为一种高效的提取方法。

2.9多针－板电晕放电提取法  多针－板电晕放电提取法仍然是一种新型的破坏藻体细胞壁的一种提取方法，该法通过过量的阴离子和阳离子发生中和而产生巨大能量的释放，使藻体细胞壁中可以产生0.4～40μm大小不一致的空腔，然后藻胆蛋白就可以通过这些空腔流出，因为等离子体的温度比低，所以不会因为热量过高而产生蛋白质的变性^[11]。与传统的提取方法相比，这种方法在操作上更加简单，效率也有很大的提高，并且耗时少、成本低，具有环保的技术优势。

2.10联合法联合法即将新的提取方法与传统的提取方法结合来应用，二者相辅相成，从而可以大量且高效的生产出目标物质的粗提物。目前，酶解法和水溶液提取、超声辅助提取和反复冷冻解冻相结合的方法已为人们所熟知。与纤维素酶结合的水溶液提取方法在蛋白质提取效率上就明显高于单一水溶液提取；Shiraku^[12]等将超声辅助提取和反复冻融法结合用于提取坛紫菜中的藻红蛋白。Santiago等^[13]也指出，联合提取在提取的含量、提取的效率上均优于某种单一方法提取，即产生了1+1>2的效果。

知识汇总自“南开细胞工程”，还有更多关于细胞破碎的信息，或您有选购细胞破碎仪的需要，欢迎联系艾塔科仪，咨询电话：400-002-7510，13006194365。