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高效液相色谱的“心脏”——色谱柱的使用与维护

发布时间:2023-01-31浏览:243

实验室仪器讲解:色谱柱的使用和维护
在日常分离分析工作中,色谱柱的正确使用和维护十分重要,色谱柱使用是否得当,直接影响色谱柱的寿命,稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中,需要注意下列问题,以维护色谱柱。

(1)柱子在装卸、更换时,动作要轻,接头拧紧要适度。必须防止较强的机械振动,以免柱床产生空隙。
(2)如果仪器用来做常规分析,样品种类有限,但分析次数多,则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱,这样有助于延长柱子的寿命。
(3)避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料,因此在调节流速时应该缓慢进行,在阀进样时阀的转动不能过缓。
(4)应逐渐改变溶剂的组成,特别是反相色谱中,不应直接从有机溶剂改变为全部是水,反之亦然。
(5)如使用柱温控制装置时,应注意在通人流动相后才能升温。
(6)一般说来色谱柱不能反冲,只有生产者指明该柱可以反冲时,才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
(7)选择使用适宜的流动相,以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一个预柱,分析柱是键合硅胶时,预柱为硅胶,可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”,避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
(8)避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注人柱内,需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
(9)经常用强溶剂冲洗色谱柱,清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时,对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡,每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右,即常规分析需要50-75mL。
(10)保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇,柱接头要拧紧,防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
(11)色谱柱使用过程中,如果压力升高,一种可能是烧结滤片被堵塞,这时应更换滤片或将其取出进行清洗;另一种可能是大分子进人柱内,使柱头被污染;如果柱效降低或色谱峰变形,则可能柱头出现塌陷,死体积增大。
(12)在完成分离分析工作之后,不应立即停机,需及时对色谱分析系统进行冲洗,一般0.5h以上,以除去色谱柱内的杂质。

3色谱柱的再生

因为高效液相色谱柱是消耗品,随着使用时间或进样次数的增加,当出现色谱峰高阵低,峰宽加大或出现肩峰时,一般来说可能是柱效下降。

(1)反相柱的再采用以甲醇:水=95: 5(V/V),纯甲醇,二氯甲烷等溶剂作流动相,顺次冲洗,每种流动相流经色谱柱的量为2030倍色谱柱体积然后再以相反顺序冲洗色谱柱。
(2)正相柱再生顺次以正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作流动相冲洗色谱柱每步注意平衡溶剂的顺序,不要颠倒每种流动相流经色谱柱的量为20-30倍柱体积(因异丙醇的粘度较大,冲洗过程中请随时注意调整冲洗的流速),用甲醇冲洗完后,再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必需严格脱水。

(3)离子交换柱的再生。长时间在高pH值和高离子强度缓冲溶液中使用,将导致色谱柱离子交换能力降低。用稀酸缓冲溶液冲洗,可使阳离子柱再生;反之,用稀碱缓冲溶液冲洗,可使阴离子柱再生。


以上色谱柱的再生方法并不是绝对的标准方法,使用者可根据自己的实际经验和目的,选择合适的并能溶解柱内污染物的溶剂作流动相,按正方向或反方向的冲洗。但是需要指出是,无论采用什么方法再生色谱柱,均不可能完全队复柱效或其他参数至新柱水平。

色谱柱的发展方向

因强调分析速度而发展出短柱,柱长3-10cm,填料粒径2-3 μm。为提高分析灵敏度,与质谱(MS)联接,而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱。细管径柱的优点是:节省流动相、灵敏度增加、样品量少、能使用长柱达到高分离度、容易控制柱温、易于实现LC-MS联用。

但由于柱体积越来越小,柱外效应的影响就更加显著,需要更小池体积的检测器(甚至采用柱上检测),更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能:输液泵能情密输出1-100μL/min的低流量,进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小,要求高灵敏度的检测器,电化学检测器和质谱仪在这方面具有突出优点。


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