高效液相色谱法基础知识集锦!（一）

高效液相色谱法

1.与气相色谱相比液相色谱的优点：

与气相色谱法相比，液相色谱法不受样品挥发性和热稳定性及相对分子质量的限制，只要求把样品制成溶液即可，非常适合于分离生物大分子、离子型化合物，不稳定的天然产物以及其他各种高分子化合物等。此外，液相色谱的流动相不仅起到使样品沿色谱柱移动的作用，而且与固定相一样，与样品分子发生选择性的相互作用，这就为控制和改善分离条件提供了一个额外的可变因素。而气相色谱法采用的流动相是惰性气体，对组分没有亲和力，仅起运载作用。

2.液相色谱特点：

高压、高速、高效、高灵敏度、高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。

3.高效液相相色谱仪的组成：

高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理系统。

4.流动相使用前必须脱气：

常用的脱气方法有：

低压脱气法(电磁搅拌、水泵抽空，可同时加热或向溶剂吹氮气)、吹氦气脱气法和超声波脱气法等。

5.梯度洗脱：

用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，通过流动相中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。

6.高压梯度(内梯度)：

特点是先加压后混合，将溶剂用高压泵增压以后输入色谱系统的梯度混合室，加以混合后送入色谱柱。

低压梯度(外梯度)：

特点是先混合后加压。在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱。

7.进样系统要求：

良好的密封性，最小的死体积，最好的稳定性，进样时对色谱系统压力、流量影响较小。

8.分离系统：

色谱柱是实现分离的核心部件。由柱管和固定相组成。柱管为直型不锈钢管。一般色谱柱长5~30cm，内径4~5mm，凝胶色谱柱内径3~12mm，而制备色谱柱内径则可达25mm。一般淋洗溶剂在进入色谱分离柱之前，先通过前置柱。HPLC柱的填料颗粒粒径一般约为3~10m，填充常采用匀浆法，色谱柱的发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。

9.检测系统：

作用——用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。紫外-可见吸收检测器、光电二极管阵列检测器、示差折光检测器、荧光检测器、电化学检测器。

10.高效液相色谱法对流动相的要求：

流动相不与色谱柱发生不可逆化学变化，以保持柱效或柱子的保留性质较长时间不变;对待测样品有足够的溶解能力；与所用检测器相匹配；粘度尽可能小，以获得较高的柱效；流动相纯度要高，价格便宜，毒性小。

11高效液相色谱法的固定相的分类：

(1)按固定相承受压力分：

刚性固体：

以二氧化硅为基质，可承受较高压力，表面可键合各种功能官能团——键合固定相，是目前应用最广泛的固定相。

硬胶：

主要用于离子交换色谱法和凝胶色谱法中，由聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成，可承受的压力较低。

(2)按孔隙深度分：

表面多孔型：

基体是球形玻璃珠，在玻璃表面涂覆一层多孔活性物质如硅胶、氧化铝、聚酰胺、离子交换树脂、分子筛等。

优点：

适用于快速分离、填充均匀紧密、机械强度高、能承受高压，适于简单的样品及常规分析；

缺点：

多孔层薄，进样量受限制；

全多孔型：

由硅胶颗粒聚集而成，比表面积大，柱容量大，小颗粒全孔型固定相孔洞浅传质速率快，柱效高，分离效果好，适合于复杂样品、痕量组分的分离分析，是目前HPLC中应用最广泛的固定相。

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